Tinción Ziehl-Neelsen

La técnica de tinción de Ziehl-Neelsen es una técnica de tinción diferencial que inicialmente fue desarrollada por Ziehl y modificada posteriormente por Neelsen, de ahí el nombre de tinción de Ziehl-Neelsen.

• Neelsen usó carbol-fuschin del experimento de Ziehl, con calor y agregó un agente decolorante usando ácido-alcohol y una contratinción usando colorante azul de metileno, desarrollando así la Técnica Ziehl-Neelsen de tinción.
• El uso de ácido-alcohol en la técnica le valió el nombre de tinción ácido-resistente y la aplicación de calor en la técnica le da el nombre de método caliente de tinción ácido-resistente, que es un nombre sinónimo de la técnica de tinción de Ziehl-Neelsen.
• Esta técnica se utiliza en microorganismos que no se tiñen fácilmente con tinciones básicas como la tinción negativa o la tinción de Gram. Uno de los microorganismos más complejos que requieren un tratamiento severo de los compuestos de Ziehl-Neelsen es el Mycobacterium spp.
• El uso de Carbol-fuschin, que es básico, se une fuertemente a los componentes negativos de las bacterias, que incluyen el ácido micólico y la pared celular lipídica. la adición de alcohol ácido junto con la aplicación de calor forma un complejo fuerte que no se puede lavar fácilmente con solventes.
• Los bacilos acidorresistentes toman el color rojo del colorante primario, carbol-fuschin.
• Mientras que las bacterias que no son acidorresistentes se decoloran fácilmente con la adición del ácido-alcohol y toman el tinte de contraste de azul de metileno y aparecen azules.
• Esta técnica se ha utilizado en la identificación de Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae.
• Tinción diferencial rápida y económica, para la identificación de microorganismos patógenos, por ejemplo M. tuberculosis.

Reactivos utilizados en la tinción de Ziehl-Neelsen

1. Carbol-Fuschin (Colorante primario)
2. Ácido sulfúrico al 20% o ácido-alcohol (Decolorante)
3. Colorante azul de metileno (contratinción) o verde malaquita

Preparación de los reactivos

Carbol-Fuschin 

• Agua destilada - 100ml
• Fucsina Básica - 1g
• Alcohol Etílico  (100% etanol)- 10ml
• Cristales de Fenol - 5ml

Alcohol ácido (3% Ácido Clorhídrico en 95% Alcohol Etílico)

• Alcohol Etílico - 95 ml
• Agua destilada - 2 ml
• Ácido Clorhídrico concentrado- 3 ml

Azul de metileno (0.25% Azul de Metileno al 1% de  Ácido Acético)

• Azul de Metileno - 0.25g
• Agua Destilada  - 99ml
• Ácido acético - 1ml

Procedimiento para la tinción

• En un portaobjetos de microscopio limpio y estéril, haga un frotis del cultivo de muestra, colocando una gota de agua estéril y tomando una colonía del cultivo. 
• Fije el frotis con calor sobre la llama azul de un mechero.
• Sobre el frotis, vierta e inunde el frotis con carbol fuschin y caliente suavemente hasta que produzca vapores.
• Deje reposar durante 3 minutos, máximo 5 minutos y lávelo con agua del grifo que fluya suavemente.
• Agregue ácido acidulado y déjelo durante 20 a 30 segundos, máximo 1 minuto. Repita este paso hasta que el frotis tenga un color rosado. *Revisar el tiempo necesario para no quemar la muestra*
• Lave el ácido con agua del grifo.
• Inunde el frotis con colorante azul de metileno/verde de malaquita y déjelo durante 1 minuto y lave con agua.
• Limpiar con una torunda o gasa empapada de alcohol la cara contraria al frotis para eliminar manchas del colorante.
• Seque al aire y examine la mancha debajo de la lente de inmersión en aceite.

Resultados e Interpretación

• Las bacterias ácido-resistentes retendrán el colorante primario, la carbolfuscina tiñéndose de color rosado.
• Las bacterias no ácido-resistentes, tomaran los colorantes usados como contra tinción, el Azul de Metileno o el Verde de Malaquita

Aplicación de la Tinción

1. Usada para la examinación e identificación de especies de Mycobacterias
2. Usada para exámenes de baciloscopia de laboratorios clínicos.
3. Usada para la diferención entre bacilos alcohol acido resistentes y bacilos no alcohol acido resistentes 
4. Usada para la identificación de algunas especies de hongos de Cryptosporidium.

Microorganismos

Las bacterias que muestran resistencia a los ácidos incluyen:

Género Mycobacterium: M.  leprae, M. tuberculosis, M. smegmatis, M. Avium complex, M. kansasii.

Género Nocardia: N.  brasiliensis, N. cyriacigeorgica, N. farcinica y N. nova.

Los ácidos rápidos también se puede atribuir a otras estructuras no clasificadas como bacterias. Éstas incluyen:

• Endosporas bacterianas
• Cabeza de espermas
• Cryptosporidium parvum
• Isospora belli
• Cyclospora cayetanensis
• Huevos/Quistes de Taenia saginata
• Quistes hidatídicos
• Sarcocistis
• Cuerpos de inclusión nuclear en el envenenamiento por plomo